本文標(biāo)題："免疫細(xì)胞染色法之雙重染色法介紹"

免疫細(xì)胞染色法之雙重染色法介紹

雙重染色法（Double stain）

利用雙重染色法可評(píng)估所培養(yǎng)之細(xì)胞比例。方法同單一染色，但在給予一

級(jí)抗體時(shí)，可加入兩種抗體同時(shí)處理，例如同時(shí)加入 mouse anti-ED1 及 rabbit

anti-GFAP 置于 4℃，隔夜（overnight），經(jīng) TBS 清洗三次（10 分鐘/次）后，先給

予一種二級(jí)抗體辨別一種細(xì)胞，處理一小時(shí)后再以 TBS 清洗三次（10 分鐘/次）

后，加入加入 peroxidase-conjugated streptavidin 于室溫下反應(yīng)三十分鐘后，再以 TBS

清洗三次（10 分鐘/次）后，以 DAB 進(jìn)行呈色反應(yīng)；觀察后，加入另一二級(jí)抗體

以辨識(shí)另一種細(xì)胞，后續(xù)操作方式同上述。顯微鏡下，觀察到不同一級(jí)抗標(biāo)示不

同種類細(xì)胞，可鑑定二種細(xì)胞所佔(zhàn)之比例

不同細(xì)胞型態(tài)比率的估算方式，是采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法在同一盤的不同

孔分別以 anti-GFAP（代表星狀膠質(zhì)細(xì)胞）或 anti-ED1（代表微小膠質(zhì)細(xì)胞）進(jìn)行

染色。在光學(xué)顯微鏡下，每孔以隨機(jī)選定四處進(jìn)行照像；然后在照片上觀察并計(jì)

算有被染色的細(xì)胞數(shù)佔(zhàn)有被染上的細(xì)胞數(shù)加上未染上的細(xì)胞數(shù)（總細(xì)胞數(shù)）之百

分比。每一孔的四個(gè)數(shù)值，平均后與其他孔的平均值相比較，可估算出不同型態(tài)

之細(xì)胞所佔(zhàn)的比率，即：

細(xì)胞數(shù)百分比 = 被染色的細(xì)胞 ÷（被染上的細(xì)胞＋未被染上的細(xì)胞）

2.免疫螢光染色法（immunofluorescence staining）

方法同單一染色，加入一級(jí)抗體置于 4℃，隔夜（overnight）；經(jīng) TBS 清洗后，

加入含有螢光物質(zhì)的二級(jí)抗體（如：fluorescein isothiocyanate〔FITC〕-conjugated anti

mouse IgG 或 Rodamin -conjugated anti-mouse IgG）避光，處理一小時(shí)后以 PBS 清

洗三次（10 分鐘/次）后即可以螢光顯微鏡觀察結(jié)果及照像。

抗體使用濃度

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